CRISPR/Cas9 y piggyBac en la edición genética de iPSC para el tratamiento de β-talasemia

Tomado de: https://www.researchgate.net/profile/Elena_Vasileva4/publication/281820095/figure/fig3/AS:281005085741074@1444008241282/Application-of-genome-editing-in-molecular-medicine-gene-therapy-disease-modeling.png

El primer caso exitoso se reportó en 2007 cuando un paciente recibió un trasplante de sus propias células madres modificadas con un transgén de la β-globina mediante un vector lentiviral; la independencia de transfusiones se observó al segundo año. Actualmente se está explorando la utilidad de la recombinación homóloga de sitio específico mediada por CRISPR/Cas9 para editar ex vivo iPSC del propio paciente ayudado por el transposón piggyBac para asegurar especificidad en la edición y a futuro trasplantar dichas células.

Tomado de:

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5286930/

2. https://genome.cshlp.org/content/24/9/1526.full.pdf+html

Trasplante de Células Madre Alogénicas para el tratatamiento de β-talasemia

Tomado de: https://www.cancer.gov/images/cdr/live/CDR700950-750.jpg

Tomado de: https://www.cancer.gov/images/cdr/live/CDR700952-750.jpg

El único mecanismo de curación efectivo para el fenotipo de β-talasemia mayor consiste en el trasplante de Células Madre Alogénicas, estas células madre son obtenidas principalmente a partir de células indiferenciadas de la médula ósea, sin embargo actualmente se utiliza células madre de sangre periférica. Los principales inconvenientes para este tipo de terapia es el rechazo del injerto porque estas células son alogénicas; el riesgo de rechazo aumenta en pacientes con fibrosis hepática e intoxicación con hierro.  

Tomado de:
1. https://sci-hub.tw/10.1016/j.hoc.2014.08.009

Animales transgénicos para el estudio de β-talasemia: Ventajas y Desventajas de los Transgénicos

Tomado de: https://sites.google.com/site/trabajodebiologia3trimestre0/_/rsrc/1429397290245/home/Transg%C3%A9nesis.png

Para el estudio de fenotipos β-talasémicos humanos, normalmente se emplea ratones transgénicos, en este ejemplo el ratón fue denominado TG-β-IVSI-6, pues presentaba la mutación IVSI-6, se empleó un vector lentiviral que contenía el gen mutado de la β-globina humana, junto con el promotor y una porción del LCR humano; este fue microinyectado en un cigoto de 8 semanas. Para identificar los clones se usó PCR cuantitativa y luego se realizó análisis sanguíneo y se aplicó FISH para comprobar el fenotipo β-talasémico. 

Ventajas de los Transgénicos

1. Los modelos de animales transgénicos permiten simular enfermedades humana, ampliando la posibilidad de experimentar con métodos terapéuticos innovadores antes de ser probados en humanos. 
2. Los vegetales transgénicos pueden ser empleados para la aplicación de métodos de terapia génica que incluyen la inmunización, convirtiéndose en vacunas orales que guíen la respuesta inmunológica a las enfermedades.
3. A nivel agrícola y ganadero, se ha podido modificar genéticamente los cultivos y el ganado para que logren ser resistentes a diferentes plagas. 
4. La modificación del ganado y su alimento ha traído beneficios económicos aumentando los ingresos de la industria alimenticia en casi 3 veces durante la última década.
5. Permite la síntesis de proteínas de alto interés biológico y nutricional por parte de los animales de granja sometidos a transgénesis.

Desventajas de los Transgénicos

1. La creación de especies animales y vegetales resistentes a plagas ocasiona un desequilibrio en el ecosistema
2. Los productos transgénicos pueden ser utilizados como herramientas del bioterrorismo.
3. Los alimentos transgénicos se han relacionado con enfermedades debido a su toxicidad, alergenicidad y teratogenicidad. 
4. Los genes de resistencia a antibióticos empleados en animales y plantas podrían ser transferidos a bacterias, creando organismos super-resistentes.
5. Los modelos de simulación de enfermedades en ocasiones no se apegan estrictamente al humano debido a las diferencias metabólicas y genéticas. 

Tomado de:

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4434229/

2. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213453016300295?via%3Dihub

3. http://sitn.hms.harvard.edu/flash/2015/allergies-and-gmos/

ADN Recombinante y β-talasemia

Tomado de: https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S2319417016000172-gr1.jpg

Se han desarrollado terapias génicas para β-talasemia, basadas en la corrección del gen de la β-globina y de los LCR del gen, para ello se han empleado vectores lentivirales (HIVd) en células hematopoyéticas indiferenciadas, reportándose la corrección del fenotipo mutado.

Tomado de: https://i0.wp.com/epidemiologiamolecular.com/wp-content/uploads/2009/02/clip-image01014.gif

Los vertebrados presentan un tipo de recombinación genética denominada V(D)J, en la que se corta y empalma segmentos no contiguos de inmunogloblina en el genoma para generar repertorios de genes codificantes de anticuerpos y proteínas receptoras de antígenos.

Tomado de:

1. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2319417016000172

2. https://www.cell.com/cell/pdf/S0092-8674(15)01411-7.pdf

Secuenciación directa del gen de la β-globina para el diagnóstico molecular de β-talasemia.

Tomado de: https://slideplayer.es/slide/3117781/11/images/13/Secuenciaci%C3%B3n+de+DNA+M%C3%A9todo+de+Sanger+automatizado.jpg

La secuenciación Sanger es el método más práctico que se usa actualmente para la detección de mutaciones en un individuo, además en los últimos años se ha logrado automatizar el proceso permitiendo un reducción en los costos. Esta prueba posibilita el análisis exacto de la secuencia que presenta la mutación y además de ellos facilita la identificación de mutaciones que son desconocidas hasta el momento.

Tomado de:

1. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1111/ijlh.12527

Prueba de Reacción en Cadena de la Polimerasa aplicada a la β-talasemia

Tomado de: http://www.iacld.ir/DL/article/detectionofeightcommonglobingenemutationinthalassemiamajorpatientsusingrealtimepolymerasechainreactionpcrhighresolutionmeltingandevagreendye.pdf

Título: Detección de ocho mutaciones comunes de genes de β-globina en pacientes con β-talasemia mayor usando la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real de alta resolución de fusión y colorante EvaGreen™.

Objetivo: Determinar la frecuencia de genotipo y fenotipo de las mutaciones más comunes de la β-globina en pacientes con talasemia mayor, usando análisis de alta resolución de fusión junto al PCR en tiempo real.

Muestra biológica: Sangre.

Ácidos Nucleicos: ADN genómico extraído mediante el kit de extracción AccuPrep® Genomic DNA.

Genes: Se usaron 8 amplicones; IVS-II-1, IVS-I-110,  IVS-I-5,  FSC 8/9,  FSC 36/37,  Codon 30,  IVSI-6, IVS-I-1.

Tipo de PCR: PCR en tiempo real, con análisis de alta resolución de fusión.

Pasos de la PCR: 35 ciclos;

                              D: 94 °C x 1 min

                              H: Temperatura variable dependiente de cada mutación x 1 min

                              E: 1) 72 °C x 1 min; 2) 72 °C x 5 min

Visualización: Curva de análisis de de alta resolución de fusión.

Tomado de: 

1. http://www.iacld.ir/DL/article/detectionofeightcommonglobingenemutationinthalassemiamajorpatientsusingrealtimepolymerasechainreactionpcrhighresolutionmeltingandevagreendye.pdf

Pruebas diagnóstico confirmatorio de la β-talasemia

Tomado de: https://academic.oup.com/ajcp/article/148/1/6/3866692

La primera prueba confirmatoria es la electroforesis de hemoglobina en la que se muestra una concentración elevada de hemoglobina A2, con hemoglobina fetal normal, sugiriendo un cuadro positivo. La segunda prueba consiste en una cromatografía líquida de alta presión que permite separar los tipos de hemoglobinas por un mecanismo de atracción catiónica por tanto, concentraciones anormales de alguna de ellas facilitan un diagnóstico. Una prueba de tamizaje es el NESTROFT que ha demostrado ser útil para detectar el fenotipo. 

Tomado de: 

1. http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0325-29572017000300003

2. https://academic.oup.com/ajcp/article/148/1/6/3866692
3. https://link.springer.com/article/10.1007/s40556-015-0040-4

Alteraciones en la epigenómica de la β-talasemia

Tomado de: https://www.whatisepigenetics.com/wp-content/uploads/2013/07/dna-chromatin-histone.jpg

El cluster de β-globina humana, se ubica en 11p15.5, sin islas CpG asociadas. El orden de los genes, en dirección 5’ a 3’ es, HBE1-HBG2-HBG1-HBBP-HBD-HBB; durante el desarrollo embrionario se dan 2 eventos de switch génico que permiten que la HbF se convierta en HbA por una sustitución de la  γ-globina por β-globina , en el que interviene la metilación del DNA y la modificación de las histonas. La metilación de las CpGs  guarda una relación inversa con la actividad del gen de la β-globina de modo que una variación excesiva en la misma aumenta la severidad de la  β-talasemia.

Tomado de:
1. http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0025-76802016000600013
2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2617773/

Alteraciones en la traducción asociadas a la β-talasemia

Tomado de: https://media.nature.com/m685/nature-assets/gim/journal/v12/n2/images/gim201012f2.jpg

Las alteraciones en la traducción que se presentan en la β-talasemia son de dos tipos: mutaciones que afectan el codón de iniciación y o por la introducción de codones de terminación prematuros. En el primer caso, la mutación requiere de la introducción de 45pb entre las posiciones -22 hasta +23 alterando el condón de iniciación (ATG). En el segundo caso, existen 2 causas:  la mutación directa creando una pausa en la traducción, o a cambios en la lectura de la secuencia por la inserción o delección de uno a algunos nucleótidos, estos cambios de la secuencia dirigen a una culminación prematura luego de alcanzar el siguiente codón sin sentido. 

Tomado de:

1. https://pdfs.semanticscholar.org/61a0/93def5f26edabe1901327d5ad4dee55dbb35.pdf

2. http://www.redalyc.org/pdf/535/53553013008.pdf

Alteraciones en la transcripción asociadas a la β-talasemia

Tomado de: http://www.bloodjournal.org/content/bloodjournal/125/24/3694/F2.large.jpg

El mecanismo molecular de la beta-talasemia es heterogéneo, incluye la mutación puntiforme y fallas en el empalme , que alteran la transcripción del RNAm, disminuyendo la síntesis de ß-globinas. La mutación puntiforme se da en las secuencias de DNA promotoras de la ß-globina que tienen una longitud de 100 pb desde el sitio donde inicia la transcripción. Asimismo existen mutaciones en los consensos de las secuencias por uniones incorrectas de nucleótidos (GT/AG) o microdelecciones que reducen la efectividad del splicing y producen un fenotipo con β-talasemia entre leve y grave.

Tomado de:

1. https://pdfs.semanticscholar.org/61a0/93def5f26edabe1901327d5ad4dee55dbb35.pdf

2. http://www.ijbmph.com/article_56102_86f757084a3462c479772468c362d3a1.pdf

Alteraciones genómicas asociadas a la β-talasemia

Tomado de: http://www.wikicardio.org.ar/images/9/92/Img-talasemia-1.png

Los genes beta encargados de la síntesis de las cadenas β-globínicas se encuentran en el cromosoma 11. Se diferencia de la alfa-talasemia ya que esta se produce por delecciones parciales o totales. Contrariamente en la  β-talasemia se conocen más de 200 mutaciones que afectan al gen de la β-globina, algunas condicionan la imposibilidad de producir cadenas β (β0) y otras, una reducción en su síntesis; dichas mutaciones afectan al funcionalismo del RNA y el daño se da en las fases de transcripción y traducción de la β globina.

Tomado de:
1. https://www.pediatriaintegral.es/wp-content/uploads/2016/xx05/03/n5-308-317_HermGlez.pdf
2. http://www.fatedocencia.info/2012/2012.pdf

β-talasemia

Tomado de:  https://odysseedubienetre.be/img/blood-disorders-2018/how-to-identify-thalassemia_3.jpg

Las talasemias son un grupo de enfermedades genéticas que se transmiten con herencia autosómica dominante y se caracterizan por una reducción en la síntesis de uno de los dos tipos de cadenas de globina ya sea alfa o beta, condicionando una eritropoyesis ineficaz o la hemólisis temprana de hematíes debido a su funcionalidad disminuida. La β-talasemia en específico, se debe a mutaciones genéticas que afectan posteriormente al funcionalismo del ARN. La intensidad del déficit depende del grado de alteración genética y puede ser parcial o total

Tomado de: 
1. https://www.pediatriaintegral.es/wp-content/uploads/2016/xx05/03/n5-308-317_HermGlez.pdf
2. https://www.catlab.cat/uploads/20160122/CI_66_Hemoglobinopatias.pdf

¡Bienvenidos a mi blog!

Saludos amigos, les doy una cordial bienvenida a mi blog que tiene el objetivo de funcionar como portafolio virtual para archivar y compartir todo mi proceso de aprendizaje durante el curso de Biología Molecular del tercer semestre de la carrera de Medicina en la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Central del Ecuador. Espero que la información compartida sea de mucha utilidad para todos.